@phdthesis{oai:obihiro.repo.nii.ac.jp:00004885,
 author = {ATCHARAPHAN, WANLOP},
 month = {2023-04-24, 2023-04-24, 2023-04-24},
 note = {2022, application/pdf, Schistosomiasis is a disease caused by blood flukes belonging to the genus Schistosoma. These parasites are endemic in 78 countries throughout the world wherein more than 240 million people suffer from the infection among over 700 million people at risk. Asian zoonotic schistosomiasis is caused by S. japonicum and S. mekongi infections. Their zoonotic nature leads to enhanced disease transmission, making schistosomiasis management challenging. Understanding the epidemiology and dynamics of the parasite’s transmission between humans and reservoir animal hosts in the field will be aided by knowledge of the genetic diversity of S. japonicum. In addition, there is no vaccine available for schistosomiasis, and thus, disease control is mainly based on MDA with praziquantel. Diagnostic tools with high sensitivity and specificity are needed to accurately assess the status of the endemicity within a community and to monitor the efficacy of the MDA program. The general aim of this study is to develop a means to obtain this information to promote MDA towards elimination of Asian zoonotic schistosomiasis.
In Chapter 1, the previous MHT protocol was modified to apply the technique for
preparation of S. japonicum single-genome DNA. The information regarding the genetic diversity of S. japonicum is indispensable to obtaining an accurate understanding of the epidemiology of schistosomiasis and the transmission dynamics of schistosomes among their definitive hosts. DNA samples originating from a single genome should be prepared to accurately examine the parasite’s genetic diversity. The miracidium, a larval stage of the parasite, can be useful material for single-genome DNA preparation. In this study, the previous protocol for the MHT was modified with 96-well plastic ELISA plates to individually collect a miracidium for single-genome DNA preparation. In addition, the effects of light conditions on hatching rates were evaluated. The results showed that the highest hatching rate was observed under the sunlight condition (92.4%), followed by fluorescent light (88.0%). The lowest hatching rate was recorded under the dark condition (4.7%). These results indicated for the first time, to our knowledge, that sunlight was the most efficient light source for the MHT. Furthermore, the study confirmed that a 0.85% NaCl solution and the dark condition prevented miracidium hatching and could be used to store the eggs until the MHT is conducted. In addition, successful amplification of 18S rRNA gene and microsatellite markers from DNA isolated from a single miracidium also confirmed the quality of the single-genome DNA for subsequent application.
In Chapter 2, recombinant antigen-based serology from S. japonicum was evaluated for the diagnosis of S. mekongi human infections. To date, no recombinant antigen has been assessed using ELISA for the detection of S. mekongi infection due to the lack of genome information of this parasite species. In this study, several recombinant S. japonicum antigens that had been developed previously were evaluated for the detection of S. mekongi infection. ELISA results showed that S. japonicum SEA at low concentration showed better diagnostic performance than the recombinant antigens tested using the archived serum samples from Cambodia. Because recombinant antigen has several advantages over crude antigen in the application with ELISA, further optimization of the recombinant antigens should be done in future studies to improve their diagnostic performance for detecting S.mekongi infection in humans.
In Chapter 3, recombinant antigen of S. mekongi TPx-1 (rSmTPx-1) was expressed, and the antigen was evaluated for its performance in detecting S. mekongi infection in humans by ELISA. Decades of use of numerous control measures, which include MDA using praziquantel, have resulted in a decrease in the prevalence of schistosomiasis mekongi. This, however, has led to a decrease in sensitivity of the Kato-Katz stool examination, which is considered the gold standard in the diagnosis of schistosomiasis mekongi. In this study, a gene coding for S. mekongi TPx-1 was cloned, and the recombinant antigen (rSmTPx-1) was expressed to develop a serological assay with high sensitivity and specificity that could replace the Kato-Katz technique. Diagnostic performance of rSmTPx-1 as an antigen in ELISA for detecting human schistosomiasis was compared with that of the recombinant antigen of S. japonicum TPx-1 (rSjTPx-1) using a panel of serum samples collected from endemic foci in Cambodia. The sensitivity and specificity of rSmTPx-1 in ELISA were 89.3% and 93.3%, respectively, whereas those of rSjTPx-1 were 71.4% and 66.7%, respectively. In addition, the higher Kappa value of 0.82, which was calculated between ELISA with rSmTPx-1 and Kato-Katz, confirmed better agreement between them than between ELISA with rSjTPx-1 and Kato-Katz (Kappa value 0.38). These results suggested that ELISA with rSmTPx-1 could be a potential diagnostic method for detecting an active human S. mekongi infection. 
In conclusion, this study has proposed two useful tools for disease surveillance and assessment of the efficacy of an MDA program that can lead to the elimination of schistosomiasis. The modified MHT can be used in field studies for recovering miracidium to prepare single-genome DNA for population genetic studies in the future. Application of additional recombinant S. mekongi antigens with ELISA might have a potential role in developing a reliable and accurate diagnostic test for detecting S. mekongi infections in humans and reservoir animals in the future., 住血吸虫症は，Schistosoma 属の吸虫によって引き起こされる寄生虫病で，世界78 ヶ国で流行が認められる。世界人口の7 億人以上がこの病気への感染の危険の下で日々の生活を営み，また，そのうちの2 億4,000 万人以上がこの寄生虫病の症状に苦しんでいる。アジアに認められる人獣共通性の住血吸虫症（アジア型住血吸虫症）は，日本住血吸虫（S. japonicum）及びメコン住血吸虫（S.mekongi）の感染によって引き起こされ，ヒトと保虫宿主動物の間でも感染が成立することから，病気の伝搬が加速され，対策がより難しくなっている。日本住血吸虫の遺伝的多様性に関する知見は，野外での寄生虫ライフサイクルにおけるヒトと保虫宿主の相互関係や，寄生虫病の疫学を理解する上で重要な情報になる。一方，住血吸虫症に対するワクチンは未だ開発されていないことから，第一選択薬Praziquantel （ PZQ ） を用いた流行地住民への集団投薬（ mass drug administration: MDA）が，住血吸虫症の流行が認められる国と地域での主要な寄生虫病対策になっている。MDA を成功裏に推進するためには，流行地住民における住血吸虫症の流行状態を正確に把握し，またMDA の効果を査定するための，高感度・高精度の診断法の導入が必要になる。そこでこの研究では，アジア型住血吸虫症の排除に向けた取り組みに必須となる情報を得るための手法として，寄生虫の集団構造解析に使用するシングルゲノムDNA の調整を目的としたミラシジウムふ化法の改良及び，メコン住血吸虫症の患者の診断を目的としたELISAの開発を行った。
第1 章では，日本住血吸虫の集団構造解析で使用するシングルゲノムDNAの調整を目的としたミラシジウムふ化法（MHT）の改良を行った。寄生虫の遺伝団的多様性に関する情報は，住血吸虫症の疫学及び，保虫宿主嗜好性など寄生虫のライフサイクルを理解するのに不可欠な情報になる。寄生虫の遺伝的多様性を正確に調べるには単一のゲノムから調整したDNA を準備する必要があり，虫卵内に形成される幼虫ミラシジウムが有用な材料になる。そこで，シングルゲノムDNA 調製用のミラシジウムを効率的に収集するため，大型の専用フラスコを用いる既存のラシジウムふ化法を，96 穴プラスチックELISA プレートでの簡易法に改良した。更に，ミラシジウムのふ化率に与える光照射の影響についても検討を加えた。その結果，日光（太陽光）下でミラシジウムのふ化を誘導した時に最も高い孵化率（92.4%）が，蛍光灯下で誘導した時に次に高いふ化率（88.0%）が，また，虫卵を暗所に置いた時に最も低いふ化率（4.7%）が得られた。これらから，通常は蛍光灯下行うMHT を日光下で行っても，効率的にミラシジウムのふ化が誘導できることが初めて明らかになった。また，虫卵を0.85% NaCl 溶液中で暗所に置くとミラシジウムのふ化が抑えられることも確認され，この条件が虫卵の保存に有用なことも解った。シングルゲノムDNA を鋳型にしたPCR では，18S rRNA遺伝子及びマイクロサテライトメーカー遺伝子が増幅され，MHT の改良法が寄生虫の集団構造解析の研究にも十分応用可能であることが確認できた。
第2 章では，日本住血吸虫由来の抗原を応用して，メコン住血吸虫症を診断するELISA の開発を行った。メコン住血吸虫症では，メコン住血吸虫のゲノム情報の不足から，未だ組換体抗原を応用したELISA が開発出来ていない。そこで，これまでに開発された日本住血吸虫由来の組換体抗原及び虫卵由来の可溶性粗抗原（SEA）の，メコン住血吸虫症を診断するELISA における有用性を評価した。カンボジア人患者及び虫卵検査（Kato-Katz 法）陰性の流行地住民から採取した血清のパネルを用いて検討した結果，低濃度SEA を抗原とするELISA に，組換体抗原を用いるELISA を上回る優れた診断性能が認められた。一方，組換体抗原を用いるELISA は，抗原の大量供給と品質管理が容易で，大規模調査への応用も可能になる。ELISA 用組換体抗原の改良と開発が待たれるところである。
第3 章では，メコン住血吸虫由来の組換体抗原を作製して，メコン住血吸虫症の診断を目的としたELISA に応用した。数十年に及ぶMDA の結果，メコン住血吸虫症流行地では，この寄生虫病の有病率が減少すると同時に感染の強度も低下したことで，Kato-Katz 法の感度が低下している。そこで，Kato-Katz 法に替わる高感度及び高特異性のELISA を開発するため，メコン住血吸虫のチオレドキシンペルオキシダーゼ-1（SmTPx-1）遺伝子を単離して，組換体タンパク質（rSmTPx-1）を大腸菌で作製した。カンボジア人患者及びKato-Katz 法陰性の流行地住民から採取した血清のパネルを用いて検討した結果，rSmTPx-1 抗原を用いたELISA の感度と特異性は，それぞれ，89.3%と93.3%であった。一方，日本住血吸虫由来の組換体タンパク質（rSjTPx-1）を抗原として用いたELISA の感度と特異性は，それぞれ，71.4%と66.7%であった。rSmTPx-1 抗原を用いたELISA とKato-Katz 法間のカッパ係数（κ係数）は0.82 で，両者には高い相関が認められた。一方，rSjTPx-1 抗原を用いたELISA とKato-Katz 法間のκ係数は0.38 であった。このことから，rSmTPx-1 抗原を用いたELISA では，虫卵を排泄するActiveな患者の検出が可能なことが示唆された。本研究では，住血吸虫症の排除に向けた，疾病流行状況の監視とMDA 効果の査定に有用な二種類の手法を提案することが出来た。改良型のMHT を野外材料からのシングルゲノムDNA の調整に応用することで，寄生虫のライフサイクル解明に有用な，遺伝団的多様性に関する情報の入手が可能になる。また，rSmTPx-1以外の組換体抗原をELISA に応用することで，メコン住血吸虫症の患者と保虫宿主動物での寄生虫感染を検出可能な，高感度及び高特異性の血清診断法の開発が可能になる。, 博士学位論文
大学院畜産学研究科 獣医学専攻
Doctoral Program of Veterinary Science},
 school = {帯広畜産大学},
 title = {Studies on modification of miracidium hatching technique (MHT) for preparation of single-genome DNA for use in population structure analysis of Schistosoma japonicum and development of ELISA for diagnosis of S. mekongi infection in humans},
 year = {}
}